Конфокальная микроскопия и TIRF Eclipse C1si

Конфокальная система, сочетающая преимущества стандартных флуоресцентных изображений и спектроскопии.

В связи с возрастающими требованиями к оборудованию для исследований, сегодня необходимы системы, позволяющие получить более точную спектральную информацию, особенно при распознавании очень близких или незначительно отличающихся спектральных цветов.

Новая система конфокальной микроскопии С1si обладает высоким уровнем гибкости, скорости и спектральными возможностями, не доступными для обычных конфокальных систем, с фотоприемными устройствами, используемыми для традиционной флуоресценции и формирования спектральных изображений, для самого широкого круга исследователей.

Функциональные особенности Eclipse C1si

Одновременная регистрация спектральных изображений по 32 каналам

В С1si применяется мульти-анодный фотоумножитель (ФЭУ) с 32 каналами, что превосходит возможности любого современного конфокального микроскопа.

Новые технологические решения, такие как составные высокоскоростные цифровые преобразователи и технология высокоскоростной передачи серийных данных с использованием дифференциальной сигнализации низкого напряжения LVDS, позволяют получать спектральные изображения по всем 32 каналам за один ход сканирования.

Это дает возможность существенно снизить время формирования изображений и наблюдать изображения в реальном времени.

Регистрация за одно сканирование в интервале 320 нм

Возможны три настройки разрешения длины волны 2.5, 5 и 10 нм. При выборе значения 10 нм за одно сканирование могут быть получены спектральные изображения по всему диапазону 320 нм, что является недостижимым для спектральных систем визуализации предыдущего поколения.

Безопасно для живых клеток и тканей

Спектральные изображения в широком диапазоне длин волн могут быть получены при однократном облучении лазерным возбуждающим излучением. Поэтому, настройка интенсивности лазерного излучения и ФЭУ представляет собой простую операцию. При этом для регистрации спектральных изображений в широком волновом диапазоне не требуется многократное сканирование, за счет чего затухание флуоресценции отмеченных участков и повреждение образца сводятся к минимуму. Система формирования спектральных изображений очень деликатно воздействует на живые клетки и ткани.

Получение реальных цветов флуоресценции

Формирование изображений спектров флуоресценции в реальных цветах было реализовано благодаря многим новым разработкам, предназначенным для точной корректировки спектральных данных и волнового разрешения независимо от диаметра точечного отверстия.

Пиковая длина волн спектра флуоресценции и разность контуров спектральных линий могут быть определены в результате регистрации спектральных данных с высокой точностью и воспроизводимостью результатов.

Даже если предварительное изображение содержит некорректные цвета, конфокальный микроскоп C1si позволяет проводить наблюдения за образцами в реальном цвете.

Пиковые значения длин волн и контуры спектральных линий в изображениях, создаваемых системой С1si, практически совпадают с данными изготовителя образцов.

Превосходная коррекция погрешностей и отклонений

Точность спектральных характеристик микроскопа поддерживается с помощью прецизионных технологий коррекции, включая волновую коррекцию с использованием спектральных линий испускания и коррекции светимости по эталонному источнику излучения, калиброванному в соответствии со стандартами Национального института стандартов и технологии NIST.

Кроме того, технология коррекции чувствительности мульти-анодного фотоэлектронного приемника (ФЭУ) позволяет выполнять коррекцию погрешности чувствительности и коэффициента пропускания в зависимости от длины волны принимаемого излучения по каждому приемному каналу, позволяя исследователям сводить к минимуму ошибки измерений и отклонения при использовании различного оборудования.

Высокое спектральное разрешение

Благодаря использованию прецизионной штриховой дифракционной решетки на ширину канала 2.5 нм, система имеет высокое спектральное разрешение и может использоваться для конфокальной спектроскопии высокого разрешения.

Два других канала шириной 5 и 10 нм могут быть использованы для разделения изображений близко расположенных образцов или изображений с частичными наложениями, а также для одновременного получения изображений четырех и более образцов.

Спектральный приемник с технологией контроля поляризации

С целью максимального повышения яркости изображений, в спектральном приемнике микроскопа C1si используется собственная разработка компании Nikon — система повышения диффракционной эффективности — DEES для контроля поляризации.

Эффективность дифракционной решетки оптимизируется путем совмещения направлений поляризации, в результате чего создаются исключительно яркие изображения.

В частности, повышение эффективности дифракции в длинноволновом диапазоне приводит к улучшенной яркости и линейности спектральных данных на всем видимом интервале от синего до красного.

Мульти-анодный фотоэлектронный приемник (ФЭУ)

В спектральном приемнике используется новый механизм экранирования лазерного излучения. Вместе с высоким волновым разрешением, не зависящим от диаметра точечного отверстия, данный механизм предохраняет отраженный лазерный луч от посторонних сигналов.

Механизм блокировки может свободно перемещаться с помощью специальной программы, позволяющей пользователям блокировать любую длину волны лазерного излучения, что обеспечивает совместимость микроскопа C1si, фактически, с любой лазерной системой.

Технология высокоэффективного пропускания света флуоресценции

На торцевые поверхности оптических волокон, передающих флуоресцентное излучение и
поверхности датчиков, наносится специальное просветляющее покрытие для снижения потерь
сигнала до минимума, что приводит к увеличению коэффициента оптического пропускания.

Обработка сигналов методом двойной интеграции – DISP

Для повышения эффективности и предотвращения потери сигнала при цифровой обработке изображений и их восстановлении, в схеме формирования изображений реализована новая технология обработки сигналов методом двойной интеграции (DISP). Сигнал контролируется в течение всего времени прохождения одного пикселя при высоком отношении S/N.

Разделение флуоресцентных сигналов без перекрестных помех

Программное обеспечение микроскопа С1si позволяет четко отделить сигналы флуоресцентно-отмеченных образцов, включая сигналы с близкими спектральными характеристиками, такими как, метки CFP, RFP, YFP и Alexa488.

Эта функция особенно полезна, в частности, при наблюдении образцов с несколькими метками со связанными молекулами белка и при исследованиях по методу FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции).

Также возможно спектральное разделение сигналов образца от автофлуоресценции.

Функции регистрации сигналов

Быстрое изменение режима фотоприемного устройства – Переключение со стандартного конфокального изображения на спектральный режим конфокальной микроскопии осуществляется нажатием переключателя на сканирующей головке. Режим формирования изображений в EZ-C1 включается автоматически.

Быстрая установка параметров – Каждый параметр спектрального приемника, например, длина волны лазерного излучения возбуждения, волновое разрешение или диапазон длин волн регистрации может быть легко установлен из меню с помощью мыши. После установки, спектральная обработка изображений может быть выполнена обычным способом. Профили параметров сохраняются для последующего использования. Биннинговая функция суммирует сигналы смежных каналов для увеличения яркости изображения. Поэтому, при определении зоны исследования, пользователи могут задать меньшую интенсивность лазерного излучения возбуждения, для минимизации повреждения образца.

Быстрая регистрация спектральных изображений – Как только параметры фотоприемника установлены, спектральные конфокальные изображения могут быть получены одним нажатием кнопки Start.
Разделение флуоресцентных изображений нажатием одной кнопки – Даже не задавая эталонных спектральных характеристик, можно выполнить разделение флуоресцентных изображений образцов по их локальным спектрам, простым построением соответствующей области исследований (ROI) на изображении и нажатием кнопки Simpe Unmixing (Простое разделение сигналов). Кнопка Unmixing (разделение сигналов) используется, когда вам необходимо выбрать цвет, которым будет отмечен
каждый флуоресцентный образец. В базе данных
C1si содержатся все спектральные характеристики
полученные от изготовителей флуоресцентных меток, которые могут быть выбраны в качестве эталонных спектров для флуоресцентного разделения. Пользователи могут также вносить в базу данных спектральные данные, полученные в процессе подготовки собственных образов
Разделенные красные флуорохромы – Красные флуорохромы, разделение изображений которых всегда считалось трудной задачей, сегодня также могут быть
легко разделены.
Фильтрация спектра

Информация о длинах волн по всему спектральному диапазону может быть получена за одну операцию по обработке изображений. При работе с микроскопом C1si не нужно сначала сканировать один выбранный диапазон длин волн, а затем повторять сканирование образца для регистрации остальной части спектра. После спектральной обработки изображений вы можете легко вывести на экран изображения, которые отфильтрованы в любом требуемом диапазоне длин волн.

Регистрация спектральных изображений в заданный временной интервал

Поскольку данные по всем спектральным каналам регистрируются при однократном сканировании, система С1si позволяет получить временно разрешенные спектральные данные. Регистрация временных серий данных может осуществляться с максимальной частотой кадров прибора, с фиксированной задержкой начала регистрации, или по временному графику, заданному пользователем.

Диаскопическое наблюдение

Система С1si позволяет получать диаскопические изображения одновременно со спектральными или обычными конфокальными изображениями. Диаскопические методы визуализации изображений включают в себя методы дифференциально-интерференционного контраста, светлого поля и фазового контраста. Это особенно полезная функция для локализации флуоресцентных меток в тканях и клетках.

Наблюдение по методу FRAP (Восстановление флуоресценции после обесцвечивания)

Благодаря макро-программе микроскоп обеспечивает возможность исследований по методу восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Лазерный луч, с высочайшей точностью настраивается на область (ROI) исследуемого образца, заданную пользователем, для проведения фотообесцвечивания. Область может иметь форму круга, эллипса, прямоугольника, точки или линии. Области в окружающем кольце также могут быть отмечены для обесцвечивания, позволяя получать обесцвеченные образцы из зон, находящихся внутри и снаружи области. Также поддерживаются другие методы FRAP, включая интервальный метод FRAP и затухание флуоресценции в обесцвеченных изображениях — FLIP.

Простое, гибкое управление микроскопом

Переключение между режимами наблюдения через окуляр и лазерным сканированием выполняется с помощью щелчка по иконке. При использовании моторизированного инвертированного микроскопа ТЕ2000-Е или прямого микроскопа ECLIPSE 90i, управление производится с помощью ПО системы С1si, которая автоматически осуществляет переключение и перераспределение световых потоков и позволяет пользователям сконцентрироваться на анализе.