Конфокальный микроскоп Nikon A1 MP+, A1R MP+

Описание

Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

Конфокальную флуоресцентную микроскопию можно рассматривать как разновидность традиционной флуоресцентной микроскопии, которая позволяет исследовать внутреннюю микроструктуру клеток, причем не только фиксированных, но и живых, идентифицировать микроорганизмы, структуры клетки и отдельные молекулы, наблюдать динамические процессы в клетках. Конфокальная флуоресцентная микроскопия в дополнение к этому обеспечила возможность трехмерного субмикронного разрешения объекта и существенно расширила возможность неразрушающего анализа прозрачных образцов. Повышение разрешающей способности достигается благодаря использованию в конфокальных микроскопах лазеров в качестве источников света и конфокальной диафрагмы для фильтрации внефокусной флуоресценции. Преимущество лазеров по сравнению с ртутными или ксеноновыми лампами заключается в монохроматичности и высокой параллельности испускаемого пучка света. Эти свойства лазерного излучения обеспечивают более эффективную работу оптической системы микроскопа, уменьшают число бликов, улучшают точность фокусировки пучка света. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Конечно, при этом лазерный луч возбуждает флуоресценцию как в точке фокуса, так и во всех слоях образца, через которые проходит. И если эта внефокусная флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива, это ухудшает разрешение оптической системы. Избавиться от внефокусной флуоресценции позволяет конфокальная диафрагма. Изменяя диаметр конфокальной диафрагмы, можно определять толщину оптического слоя вблизи фокуса лазерного луча, поэтому флуоресценция, испускаемая выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и не регистрируется. Благодаря этому конфокальная микроскопия обеспечивает улучшенное разрешение, в первую очередь вдоль оси Z.

Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.

Мультифотонный конфокальный лазерный микроскоп А1MP+ компании Nikon позволяет визуализировать сверхглубокую динамику в живых организмах со скоростью до 420 кадров в секунду. Возможно использование инфракрасного лазера 1300 нм и нового детектора NDD, не требующего десканирования, на базе GaAsP с возможностью получения изображений на глубине свыше 1,4 мм

Лазерные конфокальные микроскопы A1MP+/A1R MP+ обеспечивают быстрое и четкое получение изображений глубоких слоев ткани живых организмов, расширяя тем самым границы традиционных исследовательских методов применяемых в биологии.

Скорость получения изображений до 420 кадров/сек (512х32 пикселей) вместе с мультифотонным формированием изображений с использованием высокоэффективной оптики и резонансного сканера A1R MP+.

Получение изображений глубоких слоев ткани образца при помощи детекторов NDD, размещенных рядом с задней апертурой объектива.
Сверхчувствительные арсенид-фосфид галлиевые (GaAsP) NDD-детекторы позволяют получить изображений мозга мыши in vivo на глубине свыше 1,4 мм.

Функция автоматической юстировки лазера предусматривает быструю корректировку смещения инфракрасного лазерного луча после изменения длины волны многофотонного возбуждения.

Инфракрасный лазер подключается к микроскопу при помощи компактного оптического блока, содержащего акустооптический модулятор и выполняющего функции автоматической юстировкой лазера.

Совместимость с прямым и инвертированным микроскопами.

Обеспечивает получение оптимальных мультифотонных изображений при исследованиях мозга, других нейробиологических применений и получение in vivo изображений живых организмов.

Качество изображения

Эффективность флуоресценции увеличена на 30%, также увеличено отношение сигнал/шум.

В серии микроскопов А1 MP+ технология малого угла падения лучей применена впервые на дихроичных зеркалах, благодаря чему увеличен уровень флуоресценции на 30 %.

Стандартный метод с 45° углом падения

Характеристики отражения-пропускания
лучей сильно зависят от поляризации

Метод малого угла падения

Характеристики отражения-пропускания
лучей имеют меньшую зависимость от поляризации

Вместо квадратного точечного отверстия с плавным изменением размера впервые используется точечная диафрагма шестигранной формы. Благодаря этому при сохранении конфокальности достигается более высокая яркость, почти эквивалентная идеально круглому точечному отверстию (на 30%больше света!).


64 % площади круга / 83 % площади круга

Для увеличения эффективности и предотвращения потери сигнала при обработке пиксельных данных системой оцифровки сигнала и при сбросе, в схеме процесса обработки изображений была реализована оригинальная разработка компании Nikon – технология двойной интегрированной обработки сигнала (DISP). Сигнал отслеживается в течение всего времени приема информации с пикселя, благодаря чему достигается чрезвычайно высокое соотношение сигнал/шум. Два интегратора работают параллельно во время считывания оптической информации, что позволяет избежать пропусков.

Принцип мультифотонного возбуждения

Когда одна флуоресцентная молекула поглощает одновременно два фотона (двухфотонное возбуждение), эффективность возбуждения пропорциональна квадрату интенсивности возбуждающего излучения.
Чтобы добиться мультифотонного возбуждения, используется импульсное излучение с высокой плотностью фотонов или интенсивности. Так как лазерное излучение представляет собой очень короткие (фемтосекунды) импульсы и достигает фокальной точки после прохождения через объектив, вероятность одновременного поглощения двух фотонов становится достаточно высокой.
В случае двухфотонного возбуждения эффективность возбуждения снижается обратно пропорционально четвертой степени расстояния от фокальной плоскости. В результате только флуоресцентные молекулы расположенные в пределах объема ограниченного дифракционным пределом объектива возбуждаются и могут флуоресцировать. Этот принцип позволяет использовать NDD детекторы где для достижения конфокальных результатов не требуется точечная диафрагма.
При прохождении через образец инфракрасное излучение поглощается и рассеивается меньше, чем видимые длины волн, поэтому возбуждающее излучение может легче проникать в глубокие слои ткани.
Так как двухфотонное возбуждение сильно ограничено дифракционным пределом фокального объема, исключается необходимость использования конфокальной точечной диафрагмы для устранения попадания флуоресцентного излучения из плоскостей вне фокуса на детектор. Таким образом, обеспечивается минимизация фотоповреждений образцов и создаются условия для регистрации флуоресцентного излучения от живых образцов. При использовании NDD детектора и системы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, встроенной в мультифотонный лазер, можно получать флуоресцентные изображения более глубоких слоев ткани образцов, используя стандартный конфокальный метод.

Фемтосекундные импульсные лазеры

Когда импульсное излучение, длительностью около 100 фемтосекунд, проходит через оптику микроскопа (например, объектив), длительность импульса увеличивается из-за дисперсии групповых скоростей (изменение скорости при прохождении через стеклянную подложку), вызывая снижение пиковой мощности.
Чтобы предотвратить снижение пиковой мощности импульса, в фемтосекундных импульсных лазерах для мультифотонной микроскопии компании Nikon предусмотрены механизмы предварительной компенсации дисперсии групповых скоростей, которые восстанавливают исходную длительность импульса в образце. Механизмы предварительной компенсации были оптимизированы для оптической системы Nikon. Это позволяет получать яркие флуоресцентные изображения глубоких слоев ткани образцов при минимальной мощности лазера.

Программное обеспечение NIS-Elements C

Обычные операции, выполняемые конфокальными микроскопами Nikon

  • Все необходимые операции по регистрации изображений отображаются в одном окне.
  • Лазеры и детекторы, регистрирующие флуоресценцию от возбуждения лазером видимого диапазона, легко переключаются путем выбора флуоресцентного зонда.
  • Переключение между высокоскоростным резонансным сканером и гальвано-сканером (не резонансным) для высокого разрешениея осуществляется одним нажатием кнопки.
  • Предусмотрена одновременная фотоактивация и высокоскоростное получение изображений при помощи возбуждения лазером видимого диапазона.

Функции для получения мультифотонных изображений высокого качества

    • Функция автоматической юстировки лазера
      В случае изменения длины волны возбуждения юстировка ИК лазера осуществляется одним нажатием кнопки.
    • Функция контроля интенсивности Z
      Пользователи могут выбрать мощность лазера и коэффициент усиления ФЭУ при получении Z-стэков при помощи функции контроля интенсивности Z. Таким образом, даже при формировании изображений плотных и толстых образцов, интенсивность излучения будет оставаться постоянной.
  • Функция разделения каналов
    Функция разделения каналов компании Nikon позволяет регистрировать излучение одновременно от нескольких фотоумножителей NDD детекторов, использую одну длину волны возбуждения ИК лазера NDD и разделять перекрывающиеся спектры, предотвращать наложение спектров.
  • Функция запуска
    Микроскоп A1 MP+/A1R MP+ и программное обеспечение NIS Elements C поддерживают запуск приложений предназначенных для синхронизации интервала и времени сканирования с регистрацией электрофизиологических данных, а также для внешнего запуска сканирования.

Объективы Nikon с высокой числовой апертурой идеально подходят для получения мультифотонных изображений

Объективы с высокой числовой апертурой были разработаны для коррекции хроматической аберрации во всем диапазоне длин волны от ультрафиолетового до инфракрасного. Светопропускание повышается благодаря использованию эксклюзивной технологии Nikon Nano Crystal Coat.
В частности, линзы погружного объектива CFI Апохромат 25xW MP обеспечивают высокую числовую апертуру равную 1,10, при этом сохраняя рабочее расстояние, равное 2,0 мм. Также предусмотрено кольцо, которое корректирует хроматическую аберрацию в зависимости от глубины образца. Конструкция объектива обеспечивает угол подвода пипетки манипулятора, равный 33°, делая его идеальным для получения мультифотонных изображений глубоких тканей и для применения в физиологических исследованиях.

Nano Crystal Coat – это эксклюзивная технология покрытия линз компании Nikon, в которой применяется несколько слоев наночастиц со сверхнизким показателем преломления, созданная при разработке промышленного оборудования производящего полупроводники. Структура покрытия Nano Crystal Coat значительно снижает отражение от внешней поверхности линзы и увеличивает пропускание во всем диапазоне.

CFI75 Apochromat 25xW MP NA 1.10, WD 2.00 мм
CFI Apochromat 40xWI λS NA 1.25, W.D. 0.18 мм
CFI Apochromat LWD 40xWI λS NA 1.15, W.D. 0.60 мм
CFI Plan Apochromat IR 60xWI NA 1.27, W.D. 0.17 мм

Автоматическая юстировка лазера при изменении длины волны при мультифотонном возбуждении

При изменении длины волны лазера или предварительной компенсации дисперсии групповой скорости положение лазерного луча на задней апертуре объектива может также изменяться, что приводит к неравномерной яркости изображений или к небольшому несовпадению путей инфракрасного и видимого лазерного излучения.
Юстировка лазерного луча обычно является сложной задачей. Благодаря функции автоматической юстировки лазера в A1 MP+ компании Nikon, предусмотренной в оптическом блоке для мультифотонного возбуждения, юстировка ИК лазера выполняется автоматически одним нажатием кнопки в NIS Elements C.

Технические характеристики

A1 MP+
Порт ввода-вывода 2 лазерных порта ввода
3 порта ввода лазерного излучения
4 порта вывода сигнала для 4-х канального PMT-детектора, спектрального детектора, системы VAAS (дополнительной) и детектора стороннего производителя (FCS/FCCS/FLIM)
Лазер для мультифотонной микроскопии Совместимый лазер Mai Tai HP/eHP DeepSee (Newport Corp.)
Chameleon Vision II (Coherent Inc.)
Модуляция метод: AOTF (акустооптический настраиваемый фильтр) или AOM (акустооптический модулятор) Метод: Акустооптический модулятор
Управление: регулирование мощности, обратная маска, установка экспозиции в изучаемой области
Оптика для падающего излучения 700-1080 нм, автоматическая юстировка
Лазер для конфокальной микроскопии (опция) Совместимый лазер 405 нм, 440/445 нм, 488 нм, 561/594 нм, 638/640 нм, аргоновый лазер (457 нм, 488 нм, 514 нм), гелий-неоновый лазер (543 нм)
Модуляция метод: AOTF (акустооптический настраиваемый фильтр) или AOM (акустооптический модулятор)
управление: контроль мощности каждой длины волны, контроль экспозиции изучаемой области
Лазерный блок стандартный: LU4A 4-лазерный блок A или C-LU3EX 3-лазерный блок EX
опциональный: C-LU3EX 3-лазерный блок EX (когда в качестве стандартного лазерного блока выбран 4-лазерный блок A)
LU-N4, LU-N4S, LU-N3, LU-NV
Детектор, не требующий десканирования, (NDD) для многофотонной микроскопии Длина волны 480-650 нм
Детектор 4 PMT (ФЭУ)
Куб флуоресцентных фильтров Рекомендуемые наборы фильтров для мультифотонной микроскопии: 492SP, 525/50, 575/25, 629/53, DM458, DM495, DM511, DM560, DM593
Тип детектора Эпископический NDD детектор (для Ni-E/FN1/Ti-E)
Диаскопический NDD детектор (для Ni-E)
Эпископический GaAsP NDD детектор (для FN1)
Стандартный детектор Флуоресценции (опция) Длина волны 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения)
Детектор A1-DU4 4 PMT (ФЭУ)
A1-DUG 2 GaAsP + 2 PMT (ФЭУ)
Светофильтр 6 наборов светофильтров, крепятся в каждое из трех держателей для светофильтров рекомендованные длины волн: 450/50, 482/35, 515/30, 525/50, 540/30, 550/49, 585/65, 595/50, 700/75
Диаскопический детектор (опция) Длина волны 440-645 нм
Детектор PMT (ФЭУ)
Сканирующая головка Стандартный процесс получения изображения Сканер: гальванический сканер x2
Размер в пикселях: максимально 4096 x 4096 пикселей
Скорость сканирования:
Стандартный режим: 2 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 24 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления)
Быстрый режим: 10 к/с (512 x 512 пикселей, в оба направления), 130 к/с (512 x 32 пикселя, в оба направления)*1
Трансфокатор: 1-1000x бесступенчатый режим сканирования: X-Y, X-T, X-Z, XY вращение, в произвольном направлении
Диапазон ИК лазера 700-1000 нм
Дихроичное зеркало Метод малого угла падения лучей, позиций: 8
Стандартный фильтр: 405/488, 405/488/561, 405/488/561/638, 400-457/514/IR, 405/488/543/638, BS20/80, IR, 405/488/561/IR
Спектральный детектор (с гальваническим сканером) (опция) Количество каналов 32 канала
Диапазон улавливания волн 400-750 нм (400-650 нм для мультифотонного наблюдения)
Скорость получения спектрального изображения 4 к/с (256 x 256 пикселей), 1000 линий в секунду
Размер в пикселях: максимально 2048 x 2048 пикселей
Разрешение по длинам волн 80 нм (2,5 нм), 192 нм (6 нм), 320 нм (10 нм) диапазон длин волн меняется с шагом 0,25 нм
Разделение Высокоскоростное, точное разделение
Совместимые микроскопы Инвертированный микроскоп ECLIPSE Ti-E, микроскоп с неподвижным предметным столом ECLIPSE FN1, прямой микроскоп ECLIPSE Ni-E (с фокусирующей револьверной головкой или фокусирующим столом)
Дополнительная комплектация Система виртуальной адаптируемой диафрагмы VAAS
Программное обеспечение Воспроизведение/Формирование изображения 2D-анализ, объемное 3D-изображение, 4D-анализ, спектральное разделение
Области применения FRAP, FLIP, FRET (дополнительно), фотоактивация, получение трехмерных изображений во времени, получение многоточечных изображений во времени, колокализация
Рекомендуемые условия установки Температура от 20°С до 25°С ± 1°C, круглосуточное кондиционирование воздуха, относительная влажность воздуха 75% или меньше (без образования конденсата), темное помещение или защита микроскопа от света, виброизоляционный стол